Auteurs: Dragos Spinu, étudiant; Diana Lefter, étudiante

 

Abstract: At a global level, lung cancer ranks first as far as frequency, costs and mortality are concerned. This study aims to research possible correlations between the evolution and characteristics of no small-cell lung cancer and genetic mutations. The method used is next-generation sequencing to identify gene mutations. A difference of 4 to 5 months in the PFS average value of patients with low genomic instability was found. Though a cost-effectiveness analysis should be considered, the NGS techniques for early evaluation have an exceptional potential in the given context.

Keywords: Bronhopulmonary, cancer, NGS, genomic instability, small cell

Introduction

Le cancer broncho-pulmonaire représente le plus important cancer humain en matière de fréquence, coûts et mortalité dans le monde. Le type histologique le plus courant de cancer du poumon est le cancer du poumon non à petites cellules (85 – 90%). Bien que la plupart des cas soient liés au tabagisme, durant la dernière décennie, on a observé une augmentation de l’incidence  du cancer broncho-pulmonaire chez les non-fumeurs. Ces données suggèrent qu’il existe une prédisposition génétique. Grâce à la technique génétique, les changements moléculaires du cancer et des lésions pré-néoplasiques ont été amplement analysés.

Par le séquençage à haut débit de l’ADN, les techniques Next-Generation Sequencing (NGS) permettent la recherche des mutations dans les gènes, par le biais d’échantillons  des gènes cibles. L’utilisation de NGS chez les patients avec cancer broncho-pulmonaire offre la possibilité d’interroger rapidement les mutations connues et importantes. Dans ce contexte, on peut aussi évaluer le pronostic et les thérapies, de même que retrouver plusieurs anomalies moléculaires avec signification particulière.

Matériel et méthodes

L’objectif principal de l’étude a été la recherche des possibles corrélations entre les caractéristiques et l’évolution du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules et les mutations génétiques détectées par les méthodes de séquençage de « nouvelle génération ». Il s’agit d’une étude initiale à partir de laquelle on peut utiliser les résultats pour évaluer précocement l’évolution des cas. En ce qui concerne les autres objectifs, on a envisagé d’établir des connexions entre les profils cliniques, paracliniques, anatomopathologiques et mutationnels des patients. Également, le but a été de faire des liaisons entre le nombre total des mutations, les voies de signalisation affectées par les mutations et les gènes mutés.

Pour le groupe d’étude, on a sélectionné 50 patients de l’Institute Régional d’Oncologie Iași diagnostiqués avec cancer du poumon non à petites cellules entre les années 2012-2015. On a réalisé les processus de séquençage de l’ADN, en utilisant la technique NGS et la méthode IonTorrent®. Les échantillons examinés ont été des pièces opératoires, des biopsies pulmonaires endobronchiques ou des prélèvements de la ponction transbronchique.

L’analyse statistique groupe des paramètres cliniques, moléculaires et mutationnels. On a défini comme indicateurs de suivi de l’instabilité génomique : le nombre total de mutations, le nombre de gènes mutés, le nombre de mutations dans les voies de signalisation et le nombre de patients porteurs de mutations des gènes cibles.

La détection des modifications génétiques réalisées par NGS représente une technique moderne qui a augmenté énormément les données obtenues après le séquençage. « Les méthodes utilisées pendant plus de 25 ans, comme Sanger (chain-termination method)-  first generation sequencing ou la méthode chimique Maxam-Gilbert, elles ont été dépassées par des méthodes  Next-Gen. En contraste avec Sanger, NGS utilise des techniques multi-read, ainsi que les nucléotides de plusieurs échantillons d’ADN puissent être simultanément analysées ; le débit varie conformément à la plateforme NGS employée. Il devient alors possible de séquencer l’ensemble du génome humain ou des gènes cibles.» Le procédé de séquençage, qualifié de « massif parallèle », permet la recherche simultanée des mutations à plusieurs loci dans les maladies génétiques ; aussi, il existe la possibilité de séquencer le génome entier, identifier les nouvelles mutations et appliquer les connaissances de pharmacogénétique, oncogénétique ou épigénétique.

Bien qu’il existe de grandes différences entre les techniques utilisés par les plateformes NGS, le principe général est le même: l’échantillon d’ADN est préalablement fragmenté par des méthodes enzymatiques ou physiques (ultrasons), préparé pour s’encadrer dans une banque d’ADN (library) par ligation d’adaptateurs; les fragments obtenus subissent une amplification clonale et un processus de séquençage par une certaine technique. Finalement, il s’agit de l’analyse des données. Chaque étape a ses spécificités, selon la technique NGS utilisée.

Figure 1
<<Séquençage Haut Débit, outil incontournable de biologie moléculaire>>,
Internet: http://www.canceropole-gso.org

La plateforme IonTorrent® utilise une méthode de séquençage qui détecte les ions d’hydrogène produits par l’ADN polymérase. Les séquences amplifiées sont fixées sur un support solide, une puce semi-conductrice, qui fonctionne comme un capteur unique.

Figure 2
Ion Torrent platform [Internet]. Genomics.cn. 2016 [cité le 2 August 2016].
Disponible sur: http://www.genomics.cn/en/navigation/show_navigation?nid=2640

Déroulement de l’étude

On a fait une statistique sur les profils cliniques et paracliniques du groupe, en utilisant plusieurs paramètres déterminés au moment de l’hospitalisation: 60% de patients étaient hommes et 52% de patients étaient fumeurs; la plupart ont eu un score de performance ECOG = 1. Le diagnostic anatomopathologique chez 46 patients a été adénocarcinome, dont la majorité était au stade IV. La chimiothérapie a impliqué 90% de patients et la combinaison la plus utilisée a été la première ligne de traitement: Cisplatine-Gemcitabine (pour 48.8% de patients). On a adopté la thérapie biologique comme thérapie de première ligne pour 6.6% de patients. Tous ont bénéficié de la thérapie avec Bevacizumab (Avastin), en moyenne 4-6 cycles d’administration. Les inhibiteurs des tyrosine kinases (ITK), par exemple Erlotinib, ont été utilisés pour le traitement de maintenance ou pour la thérapie de deuxième ligne. Les patients ont reçu seulement ITK ou la combinaison ITK et Docétaxel. La progression de la maladie a été ultériorement documentée dans 60% des cas. La survie médiane sans progression a atteint 7 mois.

À la suite, on a analysé le profil mutationnel du groupe d’étude. Le panel séquencé a inclus 50 gènes connus dans le domaine de l’oncogénétique du cancer broncho-pulmonaire. Les 50 patients ont eu, au total, 2109 mutations, dont 763 sont mutations connues, qui se trouvent dans une base de données en ligne, mais dont seulement 43 expriment certainement la pathogénicité. La moyenne des nombres de mutations a été 36. On a recherché les connexions entre chaque indicateur d’instabilité génomique et la valeur de la survie médiane sans progression, en utilisant la courbe estimée de « Kaplan Meier ». Selon la valeur médiane de l’indicateur, on a divisé le groupe en deux.

Figure 3
La survie médiane sans progression (PFS) selon le nombre total de mutations
et le nombre de gènes mutés

Les corrélations ont été statistiquement insignifiantes, mais on a obtenu des différences entre la valeur moyenne de PFS. Il s’agit de 5 mois à la faveur du groupe qui avait un nombre réduit de mutations ou gènes mutés.

On a divisé les gènes selon les voies de signalisation dans lesquelles ils sont impliqués. Les voies RAS, PI3K et JAK-STAT ont eu des mutations chez tous les 50 patients. Le nombre de mutations des voies au-dessus mentionnées a été corrélé avec la valeur PFS. Par conséquent, on a obtenu une différence entre la valeur moyenne de 5-6 mois à la faveur du groupe qui avait un nombre réduit de mutations sur chaque voie analysée.

Dans les 50 gènes, on a recherché aussi la fréquence des mutations. Les gènes EGFR, KRAS et ALK (sélectionnés pour leur importance dans la clinique et dans la recherche) ont eu une fréquence des mutations de  88, 28, respectivement 70%. On a analysé le status de porteur ou non porteur de mutations en corrélation avec la valeur PFS.

Figure 4
L’analyse des mutations rapportée aux gènes.
La variation de la fréquence des mutations (de chaque gène)

Discussion

On n’a pas obtenu une signification statistique, mais on a découvert des différences entre la valeur moyenne de PFS de 4 mois à la faveur du groupe sans mutations KRAS et ALK; on n’a pas pu faire une telle connexion pour la gène EGFR (peut-être à cause d’une différence majeure entre les groupes – 44 patients avec mutations versus 6 sans mutations).

De plus, on a recherché la liaison entre le status de performance, évalué par l’index ECOG et la valeur médiane des mutations, la valeur médiane des gènes mutés, respectivement la valeur médiane des mutations sur chaque voie de signalisation. On a noté une corrélation positive entre les indicateurs d’instabilité génomique et le score ECOG (des valeurs situées entre 0-3).

L’étude a visé la pertinence de l’utilisation des techniques Next-Generation Sequencing (NGS), en nous donnant une vue d’ensemble sur l’instabilité génomique de la tumeur au niveau microsomal et quantifiée par les indicateurs mentionés. Il s’agit d’une augmentation de développement des mutations « driver » dans le cadre d’une instabilité génomique. Ainsi, on soutient la survie et la reproduction des cellules qui offre un grand avantage au clone cellulaire. Tenant compte que la statistique avait couvert seulement un groupe de 50 patients, il faut envisager l’erreur d’échantillonnage estimée (sampling error) et le début d’une étude plus étendue.

Couramment, les méthodes de séquençage de « nouvelle génération » ont déjà démontré leur immense utilité pour identifier un sous-type tumoral grace aux mutations génétiques et développer des thérapies ciblées si la tumeur a des mutations résistantes au traitement. Dans le cadre de cette étude on a retrouvé des mutations moléculaires avec une signification thérapeutique connue. On a identifié la mutation L858R dans l’exon 21 du gène EGFR chez 6 patients (12% du groupe). Ils ont reçu comme traitement des inhibiteurs des tyrosines kinases (ITK) – Erlotinib. De cette façon, on voit que NGS détient un potentiel exceptionnel dans leur parcours médical.

 

Conclusion

Par rapport aux méthodes conventionnelles de séquençage, le développement du séquençage de nouvelle génération (NGS) offre un progrès majeur au sujet du cancer du poumon non à petites cellules. Malgré l’absence d’une signification statistique, on a obtenu des différences entre la valeur moyenne de PFS de 4-5 mois à la faveur des patients avec l’instabilité génomique diminuée. On a remarqué une corrélation positive entre les indicateurs d’instabilité génomique et le score ECOG, plus précisément des valeurs situées entre 0-3.

Il faut envisager l’analyse coût-efficacité, mais aussi on doit remarquer le potentiel exceptionnel des techniques de NGS d’évaluation précoce des patients diagnostiqués avec cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules.

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